Dag 4

Hej allihoppa! Här nedantill kommer de frågor samt uppgifter som skall besvaras på efter denna dag:

Intro: Gelen från gelelektroforesen efter PCR reaktionen överfördes sedan till ett membran som användes i momentet för southern blot för detektion av LL-37 genen mha. antikroppar mot DIG i prober bundna specifikt till LL-37. 

Dag 4
Nu har du gjort både PCR och Southern. Syftet med bägge metoderna var att ta reda på om LL 37-genen fanns i plasmiden.


1. Jämför resultatet och diskutera för-och nackdelar med metoderna.

PCR:

Resultat:

 Se resultat kommentarer under Dag 2 för PCR.


Fördelar: PCR-metoden är inte lika tidskrävande som Southern Blot i och med att det inte är lika många tidskrävande delmoment. I PCR metoden får man veta att efter amplifiering av genen LL-37 finns genen i provet.

Nackdelar: Finns risk för carry-overkontamination. Men med hjälp av negativa kontrollen i PCR kan man detektera om cary-overkontamination skett.


Southern Blot:

Resultat:
Gällande markörerna 6 och 3 syns det att vi lyckats tvätta bort alla ospecifikt bundna prober mha. stringens tvätt. I brunnen för kp: klyvd plasmid syns ett tjockt starkt band längst ned, det indikerar på att proberna bundit helt specifikt till inserten för LL-37. I brunnen för klyvd produkt med låg koncentration (0.005) syns att prober bundit till LL-37 där också. I brunnen med oklyvd plasmid betyder strecket längst ned att plasmiden har en super coil struktur och strecket strax ovanför tyder på att plasmiden har en open circle struktur. Det som man ser i den tomma brunnen till höger om den för oklyvd plasmid är att oklyvda plasmiden runnit över till den tomma brunnen.

Foto:

Fördelar: Med hjälp av southern blot kan man påvisa att genen är LL-37 med hjälp av specifika prober som binder specifikt till målsekvensen för genen i DNA:t. I denna metod ser man även att LL-37 finns med i oklyvda plasmiden samt klyvda plasmiden i inserten respektive vektorn.

Nackdelar: Tidskrävande metod pga många delmoment med olika inkuberings tider. Eftersom det är många delmoment är det viktigt att utföra metoden steg för steg korrekt. Om gör fel på ett delmoment kan det hända att man måste gå tillbaka i delmomenten och göra om flera steg)


2. Vad tycker du är det viktigaste som du har lärt dig under laborationen?

Jag tycker det har varit intressant att utföra de olika metoderna som ingick i dessa labborationer. I samband med dessa även fått möjlighet att öva på pipettering . Övning ger färdighet! =)

Dag 2

Dag 2

Idag har du utfört en PCR.
Hur blev resultatet? Om du tycker att resultatet blev bra; vilka kontroller har du som gör att du kan lita på resultatet?

Resultatet av PCR:n kontrollerades mha. elektrofores. Det visade sig att vi i vårat fall i kontrollen på elektroforesen fick ett mycket svagt band i spalten för prov. Detta indikerar på att vi fått ett amplifikat av provet dvs. ett amplifikat av genen LL-37. 

MEN med hjälp av den negativa kontrollen, där det blev ett mycket svagt band, kan vi därmed konstatera att det skett en carry over kontamination (detta innebär att produker av LL-37 genen kommit via exempelvis pipetterna från förra årets labboration). Detta indikerar på att vi INTE fått en önskad produkt!

I den positiva kontrollen ser man även ett diffust svagt band längst ned, vilket indikerar på att vi fått en amplifiering av LL-37 genen efter PCR  men man skall observera att vi även fick band vid negativa kontrollen dvs vi har få fått en oönskad produkt!

I plasmidpreperationen ser man ett starkt tjockt band, vilket visar på att vi fått cccDNA och ovan den syntes ett tunnare band vilket kan påvisa strukturen av en sk. open circel från plasmid DNA. Ovan för dessa två band syntes små band ovanför varnadra, vilket idikerar på att vi inte lyckats få bort kromosomalt DNA. Längst ned i denna plasmid prep. kollon syns inte smear, vilket betyder att vi lyckats rena bort allt RNA i plasmid preperationen.

                                                  Pos.        Neg.      Amp.   MIII  Plasmidprep.

Om resultatet blev misslyckat; vad tror du är den troligaste orsaken till att det misslyckades?

Troligaste orsaken till att banden inte syns så bra kan beror på pippeteringen av Gel-red, att vi fått upp för lite Gel-red. Eftersom DNA, RNA molekyler binder till sig Gel-red blir banden inte lika starka om för lite Gel-red tillförs.

Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgången nästa labdag eller vid labuppföljningen?

Jag skulle uppskatta om man tog en kort repetition gällande resultatet efter elektroforsen. Det jag funderar på är att om det nu blivit en både oönskad och önskad produkt av just genen LL-37 spelar det ingen roll i detta fall? Spelar det inte en roll eftersom vi ska studera vidare på just amplifikat av genen LL-37? Men om det är t.ex. en person som INTE har hiv infektion visar ett band på negativa kontrollen via elektroforesen efter PCR, då bör man göra om PCR:en för att få ett korrekt resultat, eller? Med korrekt resultat menar jag att man blir extra nogrannare på att använda nya filterspetsar för att minska carryover kontamination om det nu redan finns hiv positivt svar i pipetten riskerar det att inte hamna i lösning hos en person som undersöks och som har hiv negativ egentligen?

Hej cyberspace och labboranter!

Idag har man haft första labborationsdagen då man skall "renat" en rekombinant plasmid från en bakteriesuspension.

 Nedan följer frågor som skall besvaras.

1. Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort?
Förhoppningsvis har man tagit bort E.colins, bakteriens, kromosomala DNA, RNA och proteiner.

2. Vad vet du om resultatet? Fick du ren plasmid?

 För att få ett resultat på dessa gjorde vi även koncentrations bestämning och renhetsbestämmning mha. spektrofotometern. Genom att man tog kvoten för absorbansen vid 260nm och absorbansen vid 280nm. I vårt fall fick vi ca 1,65.

Om kvoten är < 1,8 anser man att det är kontaminerat av proteiner. Vilket betyder att vi inte har fått ett renat plasmid DNA dvs. det finns spår av antingen kromosomalt DNA, RNA eller proteiner. Man bör tänka på att vid samma våglängder som man får absorbans i spektrofotometern kan komma från föroreningar dvs. inte endast från plasmid DNA:t utan även från kromosomalt DNA, RNA eller proteiner.

För att se om man fått ren plasmid måste man genomföra elektrofores för att då kunna se om t.ex. RNA smear finns.(vilket indikerar på att vid reningen har man inte lyckats rena bort RNA)

 Vid koncentrationsbestämningen fick vi fram 0,219µg/µL vilket hamnar inom referensområdet 200-300 µg/µL. En orsak till att man inte fick 50µg/µL kan vara att vid pipettering av bufferten EB 50µL inte pippeterat upp tillräcklig mycket mängd och det leder i sin tur till att man fått längre koncentration av DNA. Detta leder då till att DNA inte har eluerats, löst ut, tillräckligt. Orsaken bakom detta kan bero på att vi skulle ha haft locket i centrifugen vilket som glömdes.  

3. Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgång nästa labdag eller vid labuppföljningen?

Nej inte för tillfället.

Vad är syftet med denna blogg?

"Syftet med bloggen är att ni skall fundera över vad ni har gjort under labben."

Här nedan följer frågor för respektive laborationsdag som ska besvaras EFTER respektive laborations tillfälle. Hämtat ur pingpong. 

"Dag 1

Idag har du renat en rekombinant plasmid från en bakteriesuspension.
Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort?
Vad vet du om resultatet? Fick du ren plasmid?
Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgång nästa labdag eller vid labuppföljningen?

Dag 2

Idag har du utfört en PCR.
Hur blev resultatet? Om du tycker att resultatet blev bra; vilka kontroller har du som gör att du kan lita på resultatet?
Om resultatet blev misslyckat; vad tror du är den troligaste orsaken till att det misslyckades?
Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgången nästa labdag eller vid labuppföljningen?

Dag 4

Nu har du gjort både PCR och Southern. Syftet med bägge metoderna var att ta reda på om LL 37-genen fanns i plasmiden. Jämför resultatet och diskutera för-och nackdelar med metoderna.
Vad tycker du är det viktigaste som du har lärt dig under laborationen?"

Jag hittade även ytterligare frågor som är lämpliga att besvara UNDER och EFTER laborationerna via pingpong.:

"Frågor som är lämpliga att svara på under och efter labben

1.      Preparation av plasmid DNA inleds ofta med en alkalisk lys. Detta gäller inte vid preparation av genomiskt DNA. Förklara.

2.      Ofta blandar man lösningar med en Vortex, men vid ett steg under den alkaliska lysen stlår det i protokollet att man skall undvika att blanda med Vortex. Förklara varför.

         3.  Många gånger vill man utvärdera sin DNA-preparation vad gäller koncentration och kvalité. Hur 
              kan man gå tillväga och hur tolkar man de resultat man får?"

 



Nu undrar jag om jag missat något? Kommentera gärna! 

Hoppas att fler uppskattar denna inledning jag gjort av bloggen och kan ha som stöd och hjälp inför uppgiften att besvara labborations frågor.

Testing...

Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit. Nulla ac arcu augue, quis luctus sem. Donec sit amet justo arcu, eu ultricies odio. Nulla sit amet nisi vel est malesuada egestas sed vel metus. Nulla facilisi. Vestibulum vel mi turpis, non varius erat. Pellentesque quis iaculis nisi. Vestibulum tempor faucibus massa, sit amet imperdiet lorem pretium non. Aliquam erat volutpat. Curabitur ut eros sem, dapibus congue magna. Phasellus blandit metus et arcu convallis et tristique velit vestibulum. Curabitur ut neque non elit scelerisque laoreet.

Donec est arcu, eleifend vel fermentum vel, dignissim sit amet lectus. Fusce imperdiet dignissim justo in cursus. Suspendisse a lacus eget quam fermentum facilisis a sed felis. Phasellus in mi tortor. Integer tortor metus, suscipit in aliquet vulputate, consectetur in dolor. Donec libero odio, gravida in mollis eget, placerat in sapien. Donec eget dapibus velit. Cras ac diam nunc.

Pellentesque elementum nunc ut diam laoreet sit amet tincidunt sem ultrices. Nam neque diam, venenatis quis lacinia a, tincidunt vel sapien. Fusce sed turpis a tortor gravida dapibus. Maecenas sed elit a magna malesuada accumsan vitae pretium leo. Aliquam a nisl libero. Mauris vehicula mi quis massa tincidunt faucibus. Fusce mollis urna a ante pretium elementum. Curabitur ligula felis, bibendum quis vehicula vel, dignissim ut diam. Nulla ipsum leo, euismod sed ultricies id, condimentum in tellus. Donec a felis enim. Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit. Integer sit amet enim augue, eu cursus odio. Nunc ullamcorper lacinia arcu nec aliquam.

In magna turpis, vestibulum ac varius quis, ornare sed ante. Cras enim lorem, rutrum at vulputate nec, facilisis at odio. Nullam ac nisl non neque euismod malesuada. Class aptent taciti sociosqu ad litora torquent per conubia nostra, per inceptos himenaeos. Integer vitae dolor nec quam varius tincidunt. Maecenas auctor metus id dolor consequat quis varius turpis commodo. Morbi venenatis, risus sed laoreet pellentesque, dolor neque posuere ante, ut eleifend metus elit ac leo. Ut tincidunt erat eget urna accumsan consequat. Aliquam sit amet quam libero, consectetur placerat elit. Quisque iaculis egestas interdum. Maecenas ultricies gravida aliquam.

Mauris in diam non mi tincidunt tristique. Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit. Vivamus ultrices accumsan sem id mattis. Curabitur et nisl vel lorem gravida blandit. Nullam hendrerit, dolor eu iaculis vulputate, ligula mi adipiscing quam, interdum aliquam lectus augue et diam. Integer metus purus, placerat ut adipiscing sit amet, accumsan et nunc. Duis venenatis aliquet lacus, varius iaculis ante viverra at. Nullam eget est vel quam rutrum aliquet.