Dag 4

Hej allihoppa! Här nedantill kommer de frågor samt uppgifter som skall besvaras på efter denna dag:

Intro: Gelen från gelelektroforesen efter PCR reaktionen överfördes sedan till ett membran som användes i momentet för southern blot för detektion av LL-37 genen mha. antikroppar mot DIG i prober bundna specifikt till LL-37. 

Dag 4
Nu har du gjort både PCR och Southern. Syftet med bägge metoderna var att ta reda på om LL 37-genen fanns i plasmiden.


1. Jämför resultatet och diskutera för-och nackdelar med metoderna.

PCR:

Resultat:

 Se resultat kommentarer under Dag 2 för PCR.


Fördelar: PCR-metoden är inte lika tidskrävande som Southern Blot i och med att det inte är lika många tidskrävande delmoment. I PCR metoden får man veta att efter amplifiering av genen LL-37 finns genen i provet.

Nackdelar: Finns risk för carry-overkontamination. Men med hjälp av negativa kontrollen i PCR kan man detektera om cary-overkontamination skett.


Southern Blot:

Resultat:
Gällande markörerna 6 och 3 syns det att vi lyckats tvätta bort alla ospecifikt bundna prober mha. stringens tvätt. I brunnen för kp: klyvd plasmid syns ett tjockt starkt band längst ned, det indikerar på att proberna bundit helt specifikt till inserten för LL-37. I brunnen för klyvd produkt med låg koncentration (0.005) syns att prober bundit till LL-37 där också. I brunnen med oklyvd plasmid betyder strecket längst ned att plasmiden har en super coil struktur och strecket strax ovanför tyder på att plasmiden har en open circle struktur. Det som man ser i den tomma brunnen till höger om den för oklyvd plasmid är att oklyvda plasmiden runnit över till den tomma brunnen.

Foto:

Fördelar: Med hjälp av southern blot kan man påvisa att genen är LL-37 med hjälp av specifika prober som binder specifikt till målsekvensen för genen i DNA:t. I denna metod ser man även att LL-37 finns med i oklyvda plasmiden samt klyvda plasmiden i inserten respektive vektorn.

Nackdelar: Tidskrävande metod pga många delmoment med olika inkuberings tider. Eftersom det är många delmoment är det viktigt att utföra metoden steg för steg korrekt. Om gör fel på ett delmoment kan det hända att man måste gå tillbaka i delmomenten och göra om flera steg)


2. Vad tycker du är det viktigaste som du har lärt dig under laborationen?

Jag tycker det har varit intressant att utföra de olika metoderna som ingick i dessa labborationer. I samband med dessa även fått möjlighet att öva på pipettering . Övning ger färdighet! =)